RECENTES UTILIZAÇÕES DE IMUNOENSAIOS APLICADOS À QUÍMICA ANALÍTICA

Basicamente, os avanços no desenvolvimento de imunoensaios tem como meta satisfazer necessidades analíticas, como a simplicidade (imunoensaios homogêneos)20,27,54, sensibilidade (>zeptomoles, 1 zeptomol = 602 moléculas)7,44,55, análises multiplas (reação cruzada para um grupo ou classe)41,56, uso de marcadores não radioativos42,44, reprodutibilidade e estabilidade do sistema (sistemas reutilizáveis)14,57 e rapidez2,4,19,24.


Imunoensaios Homogêneos

Técnica mais recente empregada com o intento de se aumentar a sensibilidade destes imunoensaios é a LOCI (Luminescente Oxygen Channeling Immunoassay)58. Esta técnica utiliza duas populações de micropartículas (250 nm) adsorvidas em cadeias distintas dos pares que formam anticorpos monoclonais. Uma população é preenchida com corante "bromosquaraine" e a outra com um precursor de molécula quimiluminescente (tioxeno), juntos com um fluoróforo (quelato de európio). Um antígeno TSH (thyroid stimulating hormone) forma ponte entre diferentes partículas como resultado da ligação do par de cadeias emparelhadas de anticorpos monoclonais. Irradiação da mistura reacional com laser produz oxigênio singlete na superfície da partícula carregada com corante e esta espécie ativa difunde-se para partículas adjacentes, gerando dioxetano, que decompõe e transfere energia para o fluoróforo, o qual então emite luz. Este processo só ocorre em partículas ligadas ao antígeno. Qualquer oxigênio singlete gerado em solução é inapto a interagir com a partícula contendo tioxeno (precursor do dioxetano). Este ensaio apresenta rapidez (12 min) e alta sensibilidade, com limite de detecção para TSH menor 0,0125 mUI/L (0,002 ng/mL)58.
Ensaios homogêneos foram desenvolvidos também baseados em sistemas amperométricos de detecção59,60.
Recentemente, foram desenvolvidos ensaios homogêneos, NEEIA (Nonseparation Electrochemical Enzyme ImmunoAssay), com formatos não-competitivo (tipo sanduiche)61,62 e competitivo54. Estes ensaios basearam-se no uso de eletrodo de ouro com microporos, o qual funcionou, tanto como eletrodo de trabalho, quanto como fase sólida para imobilização de anticorpos através de uma camada quimissorvente polimérica54. A versão competitiva deste imunoensaio.
Utilizou-se a enzima fosfatase alcalina como marcador do analíto. O analito marcado compete, então, com analito livre por um número limitado de anticorpos imobilizados na interface do eletrodo. Após perído de incubação de 30 a 60 min, adiciona-se substrato (p-aminofenilfosfato) que é catalisado a p-aminofenol, espécie eletroativa em contato com o eletrodo.
Este método foi utilizado na detecção de glicosídeos cardiotônicos como digoxina e digitoxina, com limites de detecção de 0,1 nM e 10 nM, respectivamente. Verificou-se que em amostras brutas de soro não houve perda de sensibilidade para concentrações acima de 1 nM54.


Sistemas de Injeção em Fluxo Acoplados a IAs (FIIA)

Entre os avanços nas automatizações de imunoensaios, incluem-se o desenvolvimento de sistema acoplados à FIA, os quais contribuem enormemente para o aumento da velocidade de imunoensaios17,19. Estes têm sido usados tanto em IAs homogêneos quanto em heterogêneos.
Além da redução do tempo de análise, uma das vantagens oferecidas por estes sistemas, especialmente quando acoplados a IAs heterogêneos é a redução dos passos de lavagem e o fato de que o imunorreator age concentrando a amostra19. A fase sólida é usualmente feita ligando-se um anticorpo ou antígeno a partículas pré-ativadas, membranas, capilares ou outras matrizes de alta área superficial14. O glutaraldeído é um dos reagentes bifuncionais mais utilizados na imobilização destas espécies nestes tipos de suporte3. A escolha do suporte para o qual o Ac ou Ag será imobilizado é de fundamental importância. Adsorções não específicas devem ser mantidas a valor mínimo, evitando-se, assim, influência nos valores de "background" e na sensibilidade do método19, bem como na durabilidade da fase sólida14.
Embora a imobilização de antígenos apresente vantagens sobre a imobilização de anticorpos, esta requer reações específicas e orientação adequada, fato este que dificulta sua operação63. Entre os suportes mais comumente empregados na confecção destes imunorreatores estão: agarose, celulose, resinas, polímeros, sílica modificada19. Estes imunorreatores são também referidos como colunas de imunoafinidade. Entretanto, não se pode generalizar, a comparação de FIA com cromatografia por imunoafinidade2.
Recentemente, foram desenvolvidas e comparadas duas técnicas de imunoensaios para análise do herbicida atrazina. Uma delas seguiu os moldes do ELISA e outra adaptou a mesma à FIA7. Nestas investigações observou-se ganho em tempo de análise de 1h para 20 minutos, assim como a possibilidade de se reutilizar o imunorreator por até 70 vezes, sem perda do desempenho. O ELISA apresentou alta sensibilidade, detectando limites de até 9 ng/L contra 75 ng/L para o FIIA7. Outro exemplo de imunoensaio reutilizável, emprega coluna simples de troca iônica empacotada com sefarose e eluída com 50 mM de tampão(malonato) pH 5 para análise de um alergeno2. Este ensaio baseou-se na interação entre alergeno 2,4-dinitrobenzenosulfonato de sódio (DNP) conjugado a albumina bovina (BSA) e os respectivos anticorpos (IgE) marcados com isotiocianato de fluoresceína. A intensidade de fluorescência medida mostrou correlação linear com a concentração do alergeno na faixa de 0,01-2,00 mg/mL e a separação baseou-se nos diferentes pontos isoelétricos dos complexos.


Cromatografia por imunoafinidade

Consiste num dos meios mais eficazes de purificação e determinação de traços em amostras complexas. Neste sistema o analito é retido seletivamente pelo respectivo anticorpo imobilizado na coluna, enquanto demais componentes são eliminados na eluição35,64. Basicamente, a diferença entre fase sólida de imunorreatores em FIA e matrizes de fase estacionária está na nomenclatura. Resulta daí que as principais matrizes que podem ser ativadas para imobilização de anticorpos são comuns, entre estas: agarose, celulose, dextrano, poliacrilamida, trisacril, alumina e sílica64. Apesar da grande seletividade obtida, com emprego de anticorpos na confecção de fases estacionárias, há, ainda, na maioria dos casos influência de interferentes nos limites de detecção4.
Recentemente, foi desenvolvido um imunoensaio em que se utilizaram duas micro-colunas aplicadas à detecção de insulina em amostras biológicas complexas. Na dosagem em questão utilizou-se uma segunda coluna de fase reversa em linha com uma coluna por imunoafinidade. O sistema coletava a fração eluída da coluna por imunoafinidade e injetava na segunda coluna, onde eram separados e reconcentrados outros componentes. Esta combinação resultou no ganho da seletividade e limite de detecção (10 fmol), utilizando detector UV, em relação a sistemas com coluna simples4. Outras vantagens destas microcolunas conjugadas foram o reduzido volume de amostra (»100 mL) e a rapidez de análise4.


Imunossensores

Anticorpos podem ser utilizados como reagentes altamente seletivos em biossensores. Enquanto em eletrodos enzimáticos ou baseados em microrganismos são monitorados concentrações de substratos ou produtos, os imunossensores são baseados nos princípios de fase sólida de imunoensaios e nos eventos físico-químicos resultantes da interação Ac-Ag21,41. Uma das limitações dos imunossensores é que a interação Ac-Ag não é prontamente reversível65. Este fato pode ser contornado utilizando-se anticorpos de baixa afinidade ou agentes capazes de provocar dissociação do complexo Ac-Ag. Nos imunossensores são detectadas as concentrações de Ac ou Ag, tanto por mudanças diretas no transdutor, quanto por deslocamento no equilíbrio de reações (imunoensaios típicos)66. Os principais transdutores empregados são os eletroquímicos (amperométricos67,68, potenciométricos69,70, condutométricos71,72), ópticos (onda evanescente73,74, ressonância superfícial de plasma75, espectroscopia de interferência reflectométrica76) e os piezoelétricos77,78.
Recentemente, foi desenvolvido um imunoeletrodo contendo anti-IgG finamente disperso em partículas de carbono (centenas de angstrons)26. O método foi baseado em imunoensaios do tipo sanduíche, sendo parte do analito marcada com peroxidase. O método foi combinado a FIA e testado na detecção de IgG, apresentando limites de detecção de 10 pM em tempo não superior a 20 min. A adsorção não específica de proteínas sobre o eletrodo foi praticamente nula e houve boa reprodutibilidade do sistema26.
Outro eletrodo a utilizar carbono como condutor foi o empregado no imunoensaio simultâneo de fenitoína e fenobarbital57. Neste experimento competitivo, os analitos foram respectivamente marcados com sais de ferrocenoamônio (0,26 V) e cobaltoceno (-1,05 V). O experimento, embora não esteja relacionado diretamente a imunossensores, expõe a possibilidade de desenvolver sistemas para multianalitos usando marcadores de diferentes potenciais redox57.
O uso de filmes poliméricos na confecção de imunossensores amperométricos79-81, assim como o desenvolvimento de sistemas com superfícies renováveis têm sido bastante explorados23.
O monitoramento ambiental de poluentes em amostras de águas por biossensores eletroquímicos (imunossensores, sensores enzimáticos e microbianos) foi recentemente revisado82.
Os imunoensaios aplicados à detecção e quantificação de poluentes tóxicos no ambiente tem atraído atenção de muitos pesquisadores. Entretanto, apesar das inúmeras vantagens oferecidas por estes métodos, há poucos exemplos de detecção direta. Experimento baseado em detecção direta por imunossensores piezolétricos foi desenvolvido, recentemente, para o ácido 2,4-fenoxiacético, um agrotóxico. Neste sistema, os cristais piezoelétricos foram modificados com o hapteno (ácido 2,4-diclorofenoxiacético) conjugado à superfície de eletrodos de ouro ativados com moléculas como aminotiofenol, cisteamina, cistina ou outras contendo grupos silanol34.
No experimento foram testados entre outras modificações a conjugação do hapteno com albumina e dextrano. O princípio do método baseou-se na competição entre moléculas do agrotóxico imobilizadas e livres, por anticorpos livres em solução. A quantidade de anticorpos que se ligam ao eletrodo é inversamente proporcional à concentração do analito. Esta ligação, por sua vez, provoca mudanças na freqüência da microbalança de quartzo. Em geral os sistemas piezoelétricos apresentam limitações quanto a especificidade, entretanto no experimento em questão obteve-se boa especificidade, mostrando ser bastante promissor para análise de agrotóxicos34.

Texto EDITADO
FONTE: Quím. Nova vol.22 n.6 São Paulo Nov./Dec. 1999

Trabalho em uma empresa de oleo vegetal de origem do pinus,que por sua vez processo de destilação deste oleo que é utilizado pra tintas vernizes,borracha e destilação molecular sendo a unica no brasil destilado esterois a partir do oleo vegetal do pinus, tambem trabalho com CG e outras analises que envolve acidos graxos em geral.

Muito legal Adilsom, seria interessante que contribuísse para todos aqui trazendo mais informações sobre o seu trabalho.

Abraços.